- obiecte
- abstract
- introducere
- Rezultatul
- Expresia IEX-1 crește în țesutul adipos alb după hrănirea cu HFD
- Deficitul de IEX-1 face șoarecii rezistenți la obezitatea indusă de HFD
- Deficitul de IEX-1 îmbunătățește metabolismul glucozei
- Deficitul de IEX-1 inhibă inflamația grăsimilor și a ficatului indusă de HFD
- Lipsa IEX-1 crește consumul de energie datorită termogenezei crescute
- Deficitul de IEX-1 previne modificarea indusă de HFD în fenotipul macrofagului în țesutul adipos
- discuţie
- metode
- Animale și îngrijirea animalelor
- Măsurători de sânge integral și plasmă
- Teste de toleranță la glucoză și insulină
- histologie
- imunohistochimie
- imunoblotare
- Izolarea SVF și imunofenotiparea
- Extracția ARN și analiza PCR cantitativă în timp real
- Cheltuirea totală a energiei animale și producția de căldură
- analize statistice
- Mai multe detalii
- Comentarii
obiecte
abstract
Obezitatea este una dintre cele mai periculoase probleme de sănătate publică de astăzi datorită prevalenței sale ridicate (59 de milioane de americani) și asocierii sale cu o varietate de boli cronice, cum ar fi diabetul de tip 2, ateroscleroza, hipertensiunea arterială, ficatul gras nealcoolic, tulburările mediată imun. și anumite tipuri de cancer. Este asociat cu niveluri cronice scăzute de inflamație activă în țesuturile metabolice importante, inclusiv țesutul adipos și ficatul. Inflamația cronică modifică metabolismul glucozei și al lipidelor și duce la stocarea excesivă de energie și la rezistența la insulină 2, 3, 4, 5, 6. Studii recente au furnizat dovezi substanțiale că răspunsul imun înnăscut și inflamația ulterioară apar într-un stadiu mult mai timpuriu decât apariția obezității și contribuie în mod critic la patogeneza sa 2, 4, 5, 6. În special, NF-κB, un mediator inflamator central, joacă un rol major în inflamația indusă de dietă. Blocarea NF-κB și a mediatorilor săi ulteriori protejează șoarecii nu numai de rezistența la insulină indusă de rezistența la insulină, ci și de obezitatea 5, 7, 8, sugerând o legătură fundamentală între inflamație și consumul de energie. În ciuda dovezilor puternice ale implicării inflamației în dezechilibrele metabolice, principalii mediatori care deranjează echilibrul energetic cu un aport ridicat de grăsimi nu sunt complet nedefiniți.
Rezultatul
Expresia IEX-1 crește în țesutul adipos alb după alimentarea cu HFD
Deficitul de IEX-1 îmbunătățește metabolismul glucozei
Lipsa IEX-1 crește consumul de energie datorită termogenezei crescute
discuţie
Obezitatea este o tulburare cronică care apare din cauza unui dezechilibru în metabolismul energetic 2, 3, 5, 6, 8. Regulatorii fiziologici primari ai cheltuielilor de energie, în special cu aport caloric ridicat, nu sunt pe deplin înțelese. Aici prezentăm un rol necunoscut anterior al IEX-1 în metabolismul energetic. Mutația nulă IEX-1 protejează șoarecii de dezvoltarea obezității induse de HFD și a rezistenței la insulină. Șoarecii IEX-1 -/- au prezentat cheltuieli energetice crescute datorită termogenezei crescute. Studiile specifice țesuturilor arată că deficiența IEX-1 crește expresia genelor termogene și provoacă rumenirea eWAT și scWAT, în concordanță cu observarea expresiei crescute a IEX-1 exclusiv în aceste țesuturi atunci când este hrănit cu HFD. Acest lucru explică creșterea termogenezei și a cheltuielilor de energie la șoareci KO, care oferă o imagine mecanică a fenotipului slab al acestor șoareci. Studiul identifică IEX-1 ca un modulator important al metabolismului energetic în timpul aportului ridicat de calorii și oferă o nouă țintă pentru tratamentul obezității și a altor tulburări metabolice.
Modul în care deficiența IEX-1 susține AAM-urile adipoase rămâne de elucidat. IEX-1 este extrem de exprimat în macrofagele 11, 12, 14. Acesta joacă un rol crucial în reglarea apoptozei în celulele imune și controlează eterogenitatea acestora 9, 12, 16, 33, 34, 35, 36. De exemplu, am raportat anterior că IEX-1 reglează reciproc supraviețuirea celulei T și apoptoza într-un mod dependent de subset 16, 36. Deficitul de IEX-1 crește apoptoza Th1, promovând în același timp supraviețuirea celulelor Th17, ducând la un răspuns îmbunătățit al IL-17 la modelele de șoarece de colită și artrită. Poate că activitatea IEX-1 indusă de HFD în macrofage crește preferențial supraviețuirea subsetului CAM dar nu AAM în grăsimea obeză prin acțiunea sa antiapoptotică. Prin urmare, deficitul IEX-1 previne creșterea indusă de HFD a populației CAM. Cu toate acestea, datele noastre sugerează că IEX-1 este necesar pentru comutarea indusă de HFD în fenotipul ATM, reglând astfel beigingul mediat de AAM.
Macrofagele adipoase joacă un rol crucial în inflamația asociată cu obezitatea prin schimbarea fenotipului lor de la o stare antiinflamatoare (AAM) la o stare proinflamatorie (CAM) în grăsimea obeză 7, 18, 37, 38. Deficitul de IEX-1 a inhibat astfel de tranziție ATM-uri și astfel AAM-urile au fost ATM-uri predominante în WAT de șoareci IEX-1 -/- chiar și după 20 de săptămâni de HFD, oferind un mecanism prin care deficiența IEX-1 a inhibat inflamația indusă de HFD. Probabil, populația crescută AAM și inflamația atenuată la șoarecii IEX-1 -/- ar fi putut contribui la îmbunătățirea sensibilității la insulină observată la acești șoareci 32, 39. IEX-1 poate reprezenta un nou mediator al inflamației asociate obezității probabil prin rolul său în reglarea fenotipului ATM-urilor. Astfel, propunem ca IEX-1 să exercite o acțiune dublă în obezitate prin ATM-uri; (i) promovează inflamația indusă de CAM și (ii) inhibă biogeneza grăsimilor bej.
În concluzie, prezentul studiu a identificat un rol neapreciat anterior pentru IEX-1 în reglarea energiei. Deficitul de IEX-1 a indus rumenirea și a activat genele termogene în WAT prin promovarea activării alternative a macrofagelor adipoase în timpul hrănirii cu HFD. În consecință, șoarecii IEX-1 -/- au fost protejați de creșterea în greutate indusă de HFD datorită termogenezei îmbunătățite și a cheltuielilor de energie crescute. Activarea alternativă a macrofagelor a atenuat, de asemenea, inflamația indusă de HFD și a îmbunătățit rezistența la insulină. Rămâne, totuși, să se stabilească dacă susținerea AAM este principalul mecanism prin care deficiența IEX-1 inhibă dezvoltarea obezității.
metode
Animale și îngrijirea animalelor
Toate studiile la șoareci au fost efectuate în conformitate cu Ghidul NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Toate studiile au fost revizuite și aprobate de și în conformitate cu subcomitetul MGH pentru cercetarea îngrijirii animalelor. Șoarecii IEX-1 -/- au fost generați în laboratorul nostru așa cum s-a descris anterior 17. Șoareci masculi pe fundal 129Sv/C57BL/6 au fost utilizați în acest studiu. Șoarecii IEX-1 -/- și coechipierul lor WT au hrănit cu o dietă bogată în grăsimi (45% calorii din grăsimi; D12451 Research Diets Inc) sau chow normal (13,2% calorii din grăsimi) începând cu vârsta de 8 săptămâni timp de 20 de săptămâni. Animalele au fost adăpostite într-o instalație specifică fără agenți patogeni, cu un ciclu de întuneric de 12 ore lumină/12 ore în facilitățile pentru animale de MGH și li s-au dat hrană și apă ad libitum. Înregistrările de temperatură rectală au fost determinate cu un termometru de precizie FHC (FHC Bowdoin ME) în jurul prânzului. Greutatea corporală a fost monitorizată la fiecare 2 săptămâni pe tot parcursul studiului.
Măsurători de sânge integral și plasmă
Sângele întreg a fost colectat în tuburi heparinizate și plasma a fost separată prin centrifugare. Concentrațiile de insulină plasmatică au fost măsurate prin setul ELISA pentru insulină (Crystal Chem Inc, Downers Grove IL). Glicemia a fost măsurată cu glucometrul One Touch Ultra Accuchek. Colesterolul total plasmatic, trigliceridele și NEFA au fost măsurate prin test colorimetric (Wako, Cambridge MA). TNF-α și IL-10 în plasmă au fost măsurate prin kituri ELISA (eBioscience).
Teste de toleranță la glucoză și insulină
Pentru IGTT, șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu 1,5 mg glucoză/g greutate corporală după 12 ore de post 5. Glicemia a fost măsurată la 15, 30, 45, 60 și 120 min bazal din sângele din coadă folosind glucometrul. Pentru ITT, șoarecilor li s-a administrat o injecție intraperitoneală de 0,75 unități de insulină umană (Novolin, Novo Nordisk) per kg de greutate corporală după 3 ore de post 5. Concentrațiile glicemiei au fost determinate așa cum s-a descris mai sus.
histologie
După disecție, specimenele au fost fixate prin imersiune în 10% formalină tamponată, timp de 48-72 ore, deshidratate, curățate și apoi încorporate în parafină. S-au obținut secțiuni seriale (5 μm grosime) și deparafinizate, rehidratate și apoi colorate de hematoxilină și eozină. Imaginile secțiunilor au fost apoi scanate folosind un NanoZoomer și analizate folosind software-ul de vizualizare NDP (Hamamatsu, Bridgewater, NJ). Suprafața medie de adipocite de 100 de adipocite sortate aleatoriu pe specimen de secțiuni eWAT a fost determinată utilizând software-ul de vizualizare NDP.
imunohistochimie
Secțiunile de țesut încorporate în parafină fixate cu formalin au fost deparafinizate și rehidratate înainte de demascarea antigenului prin fierbere în 10 mM citrat de sodiu și permeabilizare cu 0,1% TBS-Triton timp de 15 min. Activitatea endogenă a peroxidazei a fost stinsă cu incubare cu 3% peroxid de hidrogen timp de 15 minute. Secțiunile au fost blocate în serul normal de capră și incubate cu anticorp primar anti-IEX-1 (ab65152 Abcam, Cambridge MA) sau anticorp anti-UCP1 (ab10983 Abcam) de iepure peste noapte la 4 o C. Secțiunile au fost apoi colorate cu anticorp antirabit secundar biotinilat pentru 1 ora la temperatura camerei și culoarea a fost vizualizată cu 3, 3'-diaminobenzidină (DAB) folosind kitul Vecta-color ABC (Vector Laboratories). Secțiunile pentru detectarea UCP1 au fost colorate cu anticorp secundar polimeric anti-iepure timp de 30 de minute la temperatura camerei (Biocare Medical, Brookline MA) și culoarea a fost vizualizată prin adăugarea de cromogen roșu rapid (Biocare Medical). Secțiunile au fost contracolorate cu hematoxilină înainte de deshidratare și plasarea lamelei de acoperire cu mediu de montare. Diapozitivele au fost scanate folosind un NanoZoomer și analizate folosind software-ul de vizualizare NDP (Hamamatsu, Bridgewater, NJ).
imunoblotare
Țesuturile au fost recoltate în tampon fosfat RIPA suplimentat cu inhibitori de protează și fosfatază (Sigma-Aldrich). Extractele au fost fracționate folosind 4-20% gel TGX de miniproteină (BioRad, Waltham MA), transferate pe membranele nitrocelulozice și incubate cu anticorpi primari împotriva șoarecilor IEX-1 (1: 200; sc33171 Santa Cruz Biotech, Dallas TX), UCP1 (1: 5000 de eWAT și scWAT și 1:20, 000 pentru BAT, ab10983 Abcam) sau α-tubulină (abcam) peste noapte la 4 o C. După spălarea membranelor au fost incubate cu IgG anti-iepure legat de HRP (Cell Signaling Technology) . Membranele au fost incubate cu ECLPlus (GE Healthcare, Wilmington, MA), iar chemifluorescența a fost detectată cu un aparat de fotografiat Versadoc 4000MP. Imaginile capturate au fost analizate cu software-ul ImageJ (NIH).
Izolarea SVF și imunofenotiparea
4-5 șoareci masculi pe genotip au fost eutanasiați sub anestezie profundă cu un amestec de Ketamină (120 mg/kg) + Xilazină (12 mg/kg) administrat intraperitoneal. WAT epididimale au fost colectate și tocate cu foarfece și digerate cu 1 mg/ml de colagenază II în PBS conținând CaCl2 (1,4 mM) și BSA (0,5%) timp de 30 de minute la 37 ° C într-un agitator. Digestia a fost oprită prin adăugarea unei cantități egale de DMEM conținând 10% FBS. Suspensia celulară a fost filtrată printr-un filtru de 100 μm și apoi rotită la 300 g timp de 5 minute pentru a separa adipocitele plutitoare de peleta fracției vasculare stromale (SVF). Peleta SVF a fost resuspendată în 0,5 ml tampon de liză RBC timp de 5 minute pe gheață, centrifugată timp de 5 minute la 300 g și resuspendată în tampon FACS (PBS cu 2% BSA) la o concentrație de 6 × 106 celule/ml. Celulele au fost incubate în întuneric pe gheață timp de 20 de minute în blocul Fc (BD Pharmingen, San Jose, CA). Fără celule de spălare au fost incubate cu anticorpi marcați fluorescent: F4/80-ficoeritrina, CD11c-ficoeritrina-Cy7 și CD206-Alexaflour 647 timp de încă 30 de minute, conform instrucțiunilor producătorului (BD Bioscience). Celulele au fost analizate folosind sortatorul de celule FACS Aria (BD Biosciences). Petele nepătate și simple au fost folosite pentru stabilirea compensațiilor și a porților.
Extracția ARN și analiza PCR cantitativă în timp real
Țesuturile sau adipocitele și fracțiile SVF ale eWAT au fost obținute de la șoareci sub anestezie profundă așa cum s-a descris mai sus și depozitate la -80 ° C până la extracție. ARN-ul total a fost extras folosind Trizol (Invitrogen, Carlsbad CA). ADNc a fost sintetizat utilizând trusa de sinteză a primului fir Superscript III (Invitrogen). Nivelurile de expresie a ARNm au fost măsurate prin analiza PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR) într-un Mastercycler realplex 2 (Eppendorf) folosind Kapa sybr rapid sau sondă rapidă qPCR mix (Kapa Biosystems) folosind Sybr convențional sau taqman (pentru IEX-1) grunduri. Modificările exprimării genei relative au fost normalizate la niveluri de ARNm 18S și au fost determinate folosind metoda relativă Ct.
Cheltuirea totală a energiei animale și producția de căldură
Șoarecii IEX-1 -/- și colegii WT (n = 4-5 per genotip) hrăniți fie cu HFD, fie cu ND timp de 7-8 săptămâni au fost plasați în cuști metabolice standard. Consumul de oxigen (VO 2), producția de dioxid de carbon (VCO 2), producția de căldură, activitatea motorie spontană și aportul de alimente au fost măsurate utilizând sistemul de monitorizare completă a laboratorului (TSE system Inc), un calorimetru integrat cu circuit deschis echipat cu un fascicul optic sistem de monitorizare a activității. Acești parametri au fost monitorizați pe parcursul a 3 zile consecutive (3 cicluri de întuneric și 3 cicluri de lumină) și valorile medii pentru 3 zile au fost utilizate în analize. Raportul de schimb respirator (RER) a fost calculat ca un raport de VCO2 la VO2. Compoziția corpului a fost măsurată prin analizor Echo MRI (Medical Device Company, Houston TX).
analize statistice
Toate datele sunt exprimate ca medie ± erori standard ale mediei (SEM). Diferențele dintre două grupuri sau două tratamente, incluzând nivelurile de ARNm și proteine IEX-1 la șoareci WT hrăniți cu ND și HFD, și expresia ARNm a citokinelor în ATM-uri au fost comparate cu testul t Student cu două cozi. Măsurile repetate bidirecționale ANOVA au fost utilizate pentru a compara greutatea corporală, parametrii din sânge, glicemia în timpul IGTT și ITT, nivelurile de expresie a ARNm în eWAT, scWAT, BAT și ficat, VO 2 și producția de căldură și procentele de CAM și AAM în SVF diferite grupuri. Valorile P