Inhibitorul histonei 3 lizină 9 metiltransferază chaetocină îmbunătățește prognosticul în modelul șobolanului

• obiecte
• abstract
• introducere
• Rezultatul
• Chaetocina a îmbunătățit prognosticul la șobolanii sensibili la sare Dahl (DS) cu insuficiență cardiacă
• Chaetocina a restabilit reglarea genelor mitocondriale asociate cu insuficiența cardiacă
• Chaetocina a îmbunătățit respirația mitocondrială și a crescut conținutul mitocondrial în inimile eșuate
• Insuficiența cardiacă a crescut nivelul H3K9me3 la elementele recurente și acest efect a fost inversat după tratamentul cu chaetocină.
• Chaetocina a scăzut nivelul H3K9me3 la repetările intron Pgcla
• Analiza GO a locurilor H3-up H3K9me3 repetitive inversate cu chaetocină
• discuţie
• Materiale și metode
• Livrarea de animale și droguri
• Examenele tensiunii arteriale și ecocardiografice
• Analiza morfometrică
• Reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (PCR)
• Microarray de ADN
• Chip
• secvențierea
• Schimbarea nivelului H3K9me3 la elementele repetate
• Izolarea mitocondriilor cardiace
• Cererea de oxigen mitocondrială
• Conținutul de proteine ​​mitocondriale și ADN
• analize statistice
• Stocare a datelor
• Mai multe detalii
• Informatii suplimentare
• Fișiere PDF
• Informatii suplimentare
• Comentarii

obiecte

• Stop cardiac
• Modificări posttraducționale ale histonei

abstract

Acetilarea histonei este asociată cu hipertrofie cardiacă și insuficiență cardiacă. Cu toate acestea, consecințele patologice ale modificărilor în metilarea histonelor și efectele intervențiilor cu inhibitori de histon metiltransferază asupra insuficienței cardiace nu au fost pe deplin elucidate. Ne-am concentrat asupra stării H3K9me3 în inimă și am examinat efectele inhibitorului histetinei H3K9 metiltransferază chaetocină asupra prognosticului la șobolanii sensibili la sare Dahl, un model animal de insuficiență cardiacă cronică. Chaetocina a prelungit supraviețuirea și a restabilit disfuncția mitocondrială. Analiza ChIP-seq a arătat că stresul cardiac cronic a indus o creștere a H3K9me3 în mii de repetări, inclusiv regiunile intronice ale genelor legate de mitocondrie, cum ar fi gena care codifică receptorul gamma alfa activat de proliferatorul peroxizomului. În plus, chaetocina a inversat acest efect asupra acestor site-uri repetate. Aceste date sugerează că heterocromatinizarea excesivă a elementelor repetate ale genelor mitocondriale într-o inimă deficitară poate duce la reducerea tăcerii genelor și la afectarea funcției cardiace. Astfel, chaetocina poate fi un potențial agent terapeutic pentru insuficiența cardiacă cronică.

Insuficiența cardiacă este una dintre principalele cauze de deces la nivel mondial 1, 2. Deși terapiile existente pentru insuficiența cardiacă care vizează renina-angiotensină-aldosteron și sistemul nervos adrenergic sunt eficiente 3, 4, 5, 6, 7, mortalitatea prin insuficiență cardiacă rămâne ridicată 1, 2, 8. Sunt necesare cunoștințe noi despre mecanismele care stau la baza bolii pentru a dezvolta o strategie terapeutică mai eficientă. Mitocondriile și funcția metabolică s-au concentrat pe tratamentul insuficienței cardiace deoarece sunt esențiale pentru producerea de energie miocardică, potențialul redox celular, speciile reactive de oxigen (ROS), apoptoza dependentă de mitocondrie, homeostazia calciului și metabolismul acidului gras și al glucozei.

Hipertrofia patologică și insuficiența cardiacă sunt asociate cu modificarea expresiei multor gene 9, 10, 11, 12, 13. Asakura și colab. afirmă că multe gene ale insuficienței cardiace sunt implicate în căile funcției mitocondriale, fosforilarea oxidativă și semnalizarea extracelulară 14. Modificările epigenetice joacă un rol important în reglarea activității transcripționale. Modificările histonice pot modifica structura cromatinei pentru a afecta accesul factorului de transcripție la ADN și recrutarea complexelor de transcripție în regiunile promotor/amplificator de gene 15. Se știe că acetilarea și dezacetilarea histonelor joacă un rol în dezvoltarea hipertrofiei cardiace și a insuficienței cardiace 16, 17. În plus, inhibarea activității histone deacetilazei (HDAC) previne remodelarea cardiacă 18. Inhibitorii HDAC pot avea multe mecanisme de acțiune 19, inclusiv inhibarea hipertrofiei cardiace 20, 21, autofagului 22, apoptozei 23, fibrozei cardiace 24, 25, inflamației 26, 27 și reglării contractilității cardiace 28 .

Am arătat anterior că distribuția cromozomială a trimetilării histonei H3 lizină 9 (H3K9me3) și a trimonei histonei H3 lizină 4 (H3K4me3) diferă de distribuția acetilării histonei între insuficiența normală și insuficiența cardiacă la modelele animale de insuficiență cardiacă 29. Alte dovezi sugerează că metilarea histonelor la lizina 4 (K4), K9 sau K36 histona H3 este implicată în remodelarea inimii 30, 31, 32, 33. Prin urmare, atât metilarea histonelor, cât și acetilarea histonelor pot acționa ca ținte terapeutice în tratamentul insuficienței cardiace.

H3K9me3 este asociat cu formarea de heterocromatină și este necesar pentru a determina regiunile pericentromere și telomere 34. Modificările nivelurilor H3K9me3 la diferite situri genomice, inclusiv repetarea satelitului și elemente transpozabile repetitive, sunt, de asemenea, asociate cu răspunsurile la cancer și stres 35, 36. Cu toate acestea, nu a fost elucidat nici rolul H3K9me3 la loci recurente într-o inimă deficitară, nici eficacitatea inhibitorilor histonei metiltransferazei în insuficiența cardiacă.

Prin urmare, în acest studiu, am examinat starea trimetilării H3K9 la repetarea elementelor într-o inimă deficitară și am emis ipoteza că o enzimă modificatoare de histone care afectează starea trimetilării H3K9 poate juca un rol important în insuficiența cardiacă. SU (VAR) 3-9 este o enzimă care catalizează conversia K9 în histona H3 din forma dimetilată în forma trimetilată. Chaetocina, o moleculă naturală mică produsă de ciuperci din specia Chaetomium 37, este un inhibitor al SU (VAR) 3-938. Astfel, am investigat dacă acest inhibitor al metiltransferazei H3K9 blochează progresia insuficienței cardiace într-un model animal. În acest studiu, am demonstrat că chaetocina a întârziat tranziția de la hipertrofie la insuficiență cardiacă, a restabilit disfuncția mitocondrială în inimile deficitare și supraviețuirea animalelor prelungită.

Rezultatul

Chaetocina a îmbunătățit prognosticul la șobolanii sensibili la sare Dahl (DS) cu insuficiență cardiacă

Deși conținutul de ADN mitocondrial nu a diferit între grupul martor și grupul HF, s-a observat o creștere semnificativă a conținutului de ADN mitocondrial după tratamentul cu chaetocină (Fig. 2C). Expresia genei care codifică receptorul gamma activat de proliferatorul peroxizomului, coactivatorul 1 alfa (Pgcla), care joacă un rol important în biogeneza mitocondrială și producția de energie, a fost semnificativ crescută după administrarea chaetocinei (Fig. 2D). Aceste descoperiri sugerează că chaetocina a îmbunătățit respirația mitocondrială mediată de conținutul crescut de ADN mitocondrial și expresia Pgcla în inimile eșuate.

Insuficiența cardiacă a crescut nivelul H3K9me3 la elementele recurente și acest efect a fost inversat după tratamentul cu chaetocină.

Pentru a examina starea H3K9me3 de-a lungul genomului, inclusiv elemente repetate în inimă, am efectuat imunoprecipitarea cromatinei (ChIP) pentru a analiza secvențele care prezintă H3K9me3 în LV eșuat cu sau fără tratament și controale cu chaetocină. La 6550 loci asociați cu elemente repetate, insuficiența cardiacă a cauzat o creștere a alinierii H3K9me3 comparativ cu controalele. Am definit aceste elemente ca „HF-up”. Nouăzeci și nouă la sută din loci HF-up, adică 6534 repetări, au arătat o reducere corespunzătoare a H3K9me3 ca răspuns la tratamentul cu chaetocină. În schimb, la 335 loci, am observat o scădere a alinierii H3K9me3 în inima deficitară comparativ cu o scădere a grupurilor de control. Am definit aceste elemente ca „HF-down”. Administrarea inhibitorilor a inversat acest efect în 10,4% din acești loci HF, adică 35 de repetări (Fig. 3A). Astfel, HF a crescut nivelurile de H3K9me3 la elementele care se repetă, iar chaetocina a modificat nivelurile de H3K9me3 la acești loci, așa cum era de așteptat, pe baza activității inhibitoare a metiltransferazei H3K9 în țesuturile cardiace.

( A ) Numărul de elemente repetate pentru care insuficiența cardiacă a determinat o creștere (HF-up) sau o scădere (HF-down) în H3K9me3 comparativ cu controalele (stânga). Recuperarea procentuală a trimetilării H3K9 după tratamentul cu chaetocină (dreapta). ( ) Nivelurile H3K9me3 în regiunile de repetare a intronului din Pgcla. Pătratele roșii indică o zonă care a fost identificată ca fiind îmbogățită pentru repetarea H3K9me3 la șobolanii cu insuficiență cardiacă. Casetele negre indică locurile care se repetă. Coloanele indică alinierea de citire a elementelor repetate H3K9me3. RPM, valori măsurate pe milion.

Imagine la dimensiune completă

Chaetocina a scăzut nivelul H3K9me3 pe repetarea intron Pgcla

În acest studiu, ne-am concentrat asupra regiunilor genomice aflate în imediata apropiere a genelor RefSeq. Două loci repetate în intronul Pgcla au arătat niveluri ridicate de H3K9me3 în inima deficitară, iar acest efect a fost suprimat prin tratamentul cu chaetocină (Fig. 3B). Alte site-uri repetate care prezintă niveluri crescute de H3K9me3 în inima deficitară au inclus câteva regiuni genomice situate în imediata apropiere a genelor mitocondriale. De exemplu, am identificat următoarele regiuni genetice: intron Acil-CoA dehidrogenază, lanț mediu, Acadm (Fig. 4A); două regiuni intronice ale proteinei Fe-S a NADH-ubiquinonă oxidoreductază 4, Ndufs4 (Fig. 4B); și regiunea intron pentru hexaprenil dihidroxibenzoat metiltransferază, precursor mitocondrial, Coq3 (Figura 2 suplimentară). În concordanță cu profilul epigenetic al nivelurilor de ARNm H3K9me3, Acadm și Ndufs4 au fost reciproc mai scăzute în inima deficitară, determinată de PCR cantitativă în timp real. Deși recuperarea mRNA Coq3 nu a fost semnificativă în timpul tratamentului, nivelul crescut de H3K9me3 în inima deficitară comparativ cu inima martor poate fi contribuit la o scădere a expresiei Coq3. .

Speculăm în continuare că diferența dintre o schimbare completă a H3K9me3 ca răspuns la chaetocina în elementele repetate Pgc1 și o mai mică restaurare a expresiei genei Pgc1a poate fi explicată prin apariția H3K9me3 și alte modificări epigenetice în timpul progresiei și dezvoltării hipertrofiei. stop cardiac. De exemplu, dezacetilarea histonei și metilarea ADN pot apărea în regiunea promotorului. Administrarea suplimentară a unui inhibitor HDAC poate fi mai eficientă în restabilirea expresiei ARNm la niveluri bazale.

Materiale și metode

Livrarea de animale și droguri

Toate experimentele pe animale din acest studiu au fost aprobate de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea din Keio (09088) și au fost efectuate în conformitate cu Ghidurile instituționale pentru experimentele pe animale de la Universitatea Keio. Șobolani DS masculi de cinci săptămâni au fost cumpărați de la Sankyo Labo Service Corporation, Inc. (Tokyo, Japonia). Șobolanii au fost împărțiți în patru grupuri: martor [dietă normală cu sare conținând 0,3% NaCl, NS (-)], sare normală cu chaetocină [0,25 mg/kg chaetocină (Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis), MO, SUA ), NS (ch +)], HF [dietă bogată în sare conținând 8% NaCI, HS (-)] și tratament [dietă bogată în sare cu grupe de 0,25 mg/kg chaetocină, HS (ch +)], chaetocina a fost dizolvată în dimetilsulfoxid (DMSO). Șobolanilor din grupul de tratament li s-a administrat 0,25 mg/kg chaetocină intraperitoneal de două ori pe săptămână de la vârsta de 6 săptămâni la 13 săptămâni, după cum s-a descris anterior 46. Animalele au fost sacrificate și țesuturile au fost depozitate corespunzător pentru fiecare experiment.

Examenele tensiunii arteriale și ecocardiografice

Nivelurile tensiunii arteriale au fost măsurate după 5, 8, 10 și 13 săptămâni folosind metoda manșetei cozii (BP-98 AL; Softron, Tokyo, Japonia). Inimile șobolanilor de 13 săptămâni au fost evaluate prin ecocardiografie folosind VisualSonics (Vevo 2100; VisualSonics Inc.). Procedurile detaliate pentru măsurarea tensiunii arteriale și evaluarea ecocardiografică sunt furnizate în metodele suplimentare.

Analiza morfometrică

Țesutul cardiac a fost fixat în formalină, încorporat în parafină și tăiat în secțiuni groase de 5 μm. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină-eozină sau EvG și picrosirius roșu pentru a examina morfologia și a identifica fibroza cardiacă. Pentru a evalua cantitatea de fibre de colagen, secțiunile au fost observate folosind un microscop cu fluorescență (BZ-9000; KEYENCE Japan Inc. Osaka, Japonia). Fracția de volum fibrotic a fost evaluată ca suprafața fibrotică totală (calculată de sistemul de numărare a celulelor) împărțită la volumul total de VS înmulțit cu 100.

Reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (PCR)

ADNc dublu catenar a fost sintetizat din ARN de 2 μg și a fost supus PCR cu TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) și primeri și sonde specifice genei pre-proiectate (TaqMan Gene Expression Assays: Applied Biosystems) . Procedurile detaliate pentru PCR cantitativă în timp real sunt furnizate în metodele suplimentare.

Microarray de ADN

ARN a fost extras din probe de LV de la șobolani cu insuficiență cardiacă folosind mirVana (Applied Biosystems), conform instrucțiunilor producătorului. Un amestec de ARN din trei eșantioane selectate aleatoriu în fiecare grup a fost utilizat pentru a analiza expresia genomului în întregul genom folosind un chip Oligo de șobolan 20 K (TORAY). Analiza ontologică genică a fost efectuată folosind GeneCodis3 (// genecodis.cnb.csic.es/) 47, 48, 49 .

Un gram de țesut LV per grup a fost aplicat la ChIP cu 25 μg de anticorp (vizând histonă H4 trimetilată H3 [# 8580; Abcam, Tokyo, Japonia) sau histonă K9 trimetilată H3 [# 07-442; Millipore, Temecula, CA, SUA]) sau 1 μg de iepure IgG (# 2729; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SUA). Procedurile detaliate pentru ChIP sunt furnizate în metodele suplimentare. În acest articol sunt raportate numai rezultatele ChIP împotriva histonei K9 trimetilate H3.

secvențierea

Probele de fragmente de ADN precipitate au fost fragmentate în continuare înainte de analiza secvenței (HiSeq 2000). ADN-ul genomic imunoprecipitat cu cromatină (ChIP'd) din fiecare grup și ADN-ul de intrare au fost secvențiate conform instrucțiunilor producătorului (Illumina). Mai multe detalii despre alinierea citită sunt furnizate în metodele suplimentare.

Schimbarea nivelului H3K9me3 la elementele repetate

Am aliniat valorile H3K9me3-ChIP'd cu proprietăți genomice prin compilarea genomului de șobolan rn4 și a unei baze de date cu repetiții de șobolani de la UCSC RepeatMasker. Dacă raportul dintre numărul de nucleotide care se suprapun între elementele care se repetă și datele secvențiate la numărul minim de nucleotide din elementele care se repetă sau din citirea secvențiată a fost de 90% sau mai mult, am considerat că este „suprapus”. Pe elemente repetate, am identificat regiunile îmbogățite cu H3K9me3 ca având diferențe de 100 de ori în H3K9me3 în comparație cu ADN-ul de intrare.

Izolarea mitocondriilor cardiace

Mitocondriile au fost proaspăt izolate din inimile vechi de 13 săptămâni, după cum s-a descris anterior 50. Mai multe detalii sunt date în metodele suplimentare.

Cererea de oxigen mitocondrială

Consumul de oxigen mitocondrial (respirația mitocondrială) a fost măsurat cu un electrod Clark O2 folosind un oxigen Meter Model 781 și o cameră respiratorie închisă Mitocell MT200 (Strathkelvin Instruments) la 37 ° C așa cum s-a descris anterior 50, 51. Mai multe detalii sunt date în metodele suplimentare.

Conținutul de proteine ​​mitocondriale și ADN

Concentrațiile de proteine ​​în fracțiile mitocondriale au fost măsurate folosind teste de proteine ​​BCA. ADN-ul mitocondrial izolat din inimă a fost analizat prin PCR cantitativă în timp real folosind un sistem de timp în vrac Cycler Dice TP800 (Takara Bio Inc., Shiga, Japonia). Toate probele au fost normalizate pentru conținutul de ADN genomic. Secvențele primer și sondă pentru fiecare PCR sunt enumerate în Tabelul 2 suplimentar.

analize statistice

Ratele de supraviețuire cumulative ale șobolanilor din diferite grupuri au fost comparate utilizând teste log-rank. Toate rezultatele sunt prezentate ca mijloace și abateri standard (SD). Comparațiile statistice au fost efectuate folosind analiza unică a varianței (ANOVA) cu corecții post-Bonferroni în figurile 1A-D și 4 și corecțiile post-hoc Dunnett din figurile 2B-D.

Stocare a datelor

Datele Microarray și ChIP-seq sunt stocate în GEO sub numerele de acces GSE66617 și GSE69194.

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Ono, T. și colab. Inhibitorul histonei 3 lizinei 9 metiltransferazei chaetocină îmbunătățește prognosticul la un șobolan model de insuficiență cardiacă indusă de o dietă bogată în sare. Știință. reprezentant. 7, 39752; doi: 10, 1038/srep39752 (2017).

Nota editorului: Springer Nature rămâne neutru în revendicările de jurisdicție în hărțile publicate și asociațiile instituționale.

Informatii suplimentare

Fișiere PDF

Informatii suplimentare

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă găsiți ceva jignitor sau nu respectați termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind nepotrivit.