Noi abordări ale diagnosticului bolilor lizozomale bazate pe determinarea oligozaharidelor libere în urină
Abstract:
Diagnosticul bolilor lizozomale necesită o abordare foarte personalizată, deoarece aceste boli acoperă o gamă largă de tulburări metabolice moștenite cu baze moleculare diferite. Pe lângă metodele tradiționale, analiza structurală a oligozaharidelor libere din urina pacienților utilizând spectrometria de masă MALDI TOF/TOF devine o alternativă rapidă și promițătoare. Cu această nouă abordare diagnostică, am definit cu precizie profilurile reprezentative ale oligozaharidelor libere conținute în urină, tipice tulburărilor selectate ale metabolismului glicoconjugaților.
Cuvinte cheie: diagnostice, glicogenoză, boli lizozomale, MALDI TOF/TOF
* Toate tabelele, graficele și cifrele care fac parte din articol pot fi găsite în fișierul PDF atașat la sfârșitul studiului.
Introducere
În ciuda presupunerii estimate că până la 300.000 de persoane din Slovacia suferă de boli rare (1), natura moleculară a acestor boli este de multe ori unică și, prin urmare, diagnosticul lor necesită o abordare personalizată la maximum. Tulburările de stocare lizozomală (LSD) formează un grup larg de boli metabolice rare moștenite, în cadrul cărora le împărțim în:
A.) tulburări ale scindării și degradării glicanilor și glicoproteinelor (de exemplu, alfa și beta-mannozoză, sialidoză), glicolipide (de exemplu, gangliozidoza GM1, Gaucher și boala Fabry), glicozaminoglicanii (de exemplu, MPS I-III) și mucopolizaharidele (de exemplu, MPS IV), B.) tulburări ale scindării și degradării lipidelor - sfingolipide (de exemplu Niemann Pick tip A sau B) și triacilgliceride, C.) tulburări ale degradării proteinelor și D.) tulburări ale proteinelor de transport lizozomal (de exemplu mucolipidoză III și IV ) (2).
LSD-urile individuale sunt însoțite de acumularea de produse nedegradate în țesuturi și glicoconjugați în urină din cauza activității insuficiente a enzimelor degradante lizozomale (hidrolaze). Unele dintre ele, de ex. oligozaharidele libere (FOS) au un profil caracteristic specific bolii. FOS poate fi detectat printr-o metodă de diagnostic rapidă, precisă și neinvazivă - spectrometrie de masă tandem MALDI-TOF/TOF, care definește cu exactitate compoziția structurală a oligozaharidelor acumulate în urină și reprezintă o alternativă la tehnicile tradiționale de screening, cum ar fi cromatografia în strat subțire ( Comparând mobilitatea FOS prezentă în probă cu un amestec standard de oligozaharide cu 1-9 unități de hexoză. Această metodă este o abordare adecvată de screening inițial, în cazul limită, resp. Cu toate acestea, cu un rezultat pozitiv, caracterizarea ulterioară a profilului observat este esențială. Analiza MALDI TOF/TOF de mare randament este o aplicație adecvată pentru a distinge dacă FOS cumulativ provine din dietă sau este compus din metaboliți patologici specifici.
Bolile LSD se caracterizează prin semne clinice multisistemice cu progresie susținută datorită acumulării persistente de substrat nedegradat. Unele simptome pot părea inițial nesemnificative, resp. tipic pentru o altă boală sau mai frecventă (de exemplu vărsături, hipoglicemie, hipotensiune arterială, letargie, convulsii, surditate, eșec general, prosperitate, întârziere psihomotorie) și poate apărea la orice vârstă, de la fetal la senil. Prevalența combinată a LSD este de până la 1: 5.000 de nașteri vii (3) și, prin urmare, diagnosticul lor precoce și fiabil este un factor esențial care influențează viața pacienților și a familiilor lor. Departamentul de Glicobiologie al Institutului de Chimie al Academiei Slovace de Științe în cooperare cu Centrul pentru Tulburări Metabolice Moștenite NÚDCH din Bratislava a introdus și optimizat o metodă analitică pentru profilurile de oligozaharide libere urinare, care are o precizie ridicată, specificitate, sensibilitate și poate fi utilizat pe lângă abordarea de diagnostic inițială.de asemenea în cazul monitorizării eficacității terapiei.
Material și metodă
Probele de urină prelevate de la pacienții cu diverse boli lizozomale (beta-mannozoză, alfa-mannozoză, diferite tipuri de mucopolizaharidoză, mucolipidoză, gangliozoză tip I și II, sialidoză) și glicogenoză II. tip (boala Pompe), resp. de la subiecți fiziologici sănătoși ca martori negativi, au fost depozitați la -20 ° C până la procesare. După îndepărtarea sedimentului insolubil, urina diluată a fost liofilizată și probele astfel uscate au fost derivatizate prin permetilare (PerMe) cu iodometan în mediu NaOH bazic, al cărui exces a fost ulterior îndepărtat prin extracție cu cloroform. După uscare, PerMe FOS preparat a fost reconstituit în metanol 50% și aplicat pe o placă MALDI într-un raport 1: 1 cu o matrice de acid 2,5-dihidroxibenzoic. Analiza PerMe FOS a fost efectuată pe un spectrometru de masă tandem (UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF, Bruker Daltonics, MA, SUA) în modul reflecton ion pozitiv. Interpretarea postanalitică a spectrelor măsurate a fost procesată de software-ul GlycoWorkbench și ProteinScape 3.0.
Rezultatele
Profilurile caracteristice de urină pentru 7 LSD selectate au fost determinate prin analiza FOS permetilat. Au fost observate mai multe oligozaharide libere standard în spectrele FOS ale probelor martor (controale sănătoase), care sunt prezente în toate grupele de vârstă, în special m/z 838,40, 879,43, 1,240,61 și 1,274,62. FOS specifice derivate din laptele matern au fost confirmate în spectrele neonatale ale laptelui matern. Rezultatele obținute ale analizelor de profil FOS sunt în conformitate cu datele publicate în literatură (4,5).
Profiluri LSD reprezentative FOS (poza 1), obținute prin analiza MALDI TOF/TOF a oligozaharidelor permetilate conținute în urina pacienților, reprezintă o compoziție tipică de oligozaharide rezultată din disfuncție sau activitate mai scăzută a hidrolazelor lizozomale specifice:
Discuţie
Analiza oligozaharidelor libere în urină a 7 probe de referință ale pacienților cu LSD utilizând spectrometrie de masă (MALDI TOF/TOF) a identificat compoziția structurală a oligozaharidelor prezente. Determinarea structurii exacte a oligozaharidelor împreună cu tehnicile de screening utilizate este o metodă eficientă și rapidă în diagnosticul bolilor lizozomale selectate înainte de analiza genetică moleculară ulterioară. Avantajul său, în plus față de sensibilitatea și precizia ridicată, constă în premisa automatizării simple în format cu 96 și multi-godeuri, care poate fi utilizată în cazul screening-ului cu suprafață completă sau neonatală.
Profilarea și crearea bazelor de date de referință ale oligozaharidelor gratuite conținute în probele de pacienți ale acestor boli depinde de disponibilitatea probelor. Caracterizăm prezența oligozaharidelor libere specifice în urină a șapte boli LSD confirmate genetic obținute de la Centrul pentru tulburări metabolice ereditare NÚDCH din Bratislava. Din bazele de date internaționale cunoaștem alte câteva spectre de referință LSD, de ex. pentru fucozidoză, aspartilglucosaminurie, boala Gaucher și altele (4,5). Deoarece acestea sunt boli foarte rare, capacitatea de a adăuga profiluri FOS de referință este limitată în funcție de numărul de pacienți cu LSD diagnosticați. De exemplu, până în prezent, nu există niciun pacient care să sufere de fucozidoză în Slovacia. Cu toate acestea, odată cu screening-ul fiabil în continuă evoluție și detectarea precoce a pacienților, se vor adăuga treptat profilurile FOS ale tuturor celor 60 de boli LSD și se va efectua un studiu detaliat, care ar discuta, de asemenea, rezultatele profilelor FOS în funcție de vârstă, progresia bolii, etc. Cooperarea dintre medici și laboratoarele științifice contribuie la verificarea și clarificarea mai amănunțită a ambiguilor, resp. constatări limită în screeningul selectiv pentru LSD suspectat.
Concluzie
Cromatografia în strat subțire (TLC) este în prezent metoda primară și standard pentru analiza oligozaharidelor libere din urină în laboratoarele clinice. TLC are limitări în specificitatea și sensibilitatea testelor și nu oferă analiza structurală a oligozaharidelor FOS, care este adesea necesară în diagnosticul bolilor lizozomale. Într-o serie de mai multe boli LSD și probe de urină de control, am aplicat metode de spectrometrie de masă MALDI TOF/TOF și am determinat structurile oligozaharidelor dominante pentru subtipurile selectate. Metoda prezentată reprezintă un beneficiu semnificativ în diagnosticul LSD, accelerează procesul de luare a deciziilor de diagnostic și este disponibilă în prezent în Slovacia pentru pacienții cu suspiciunea uneia dintre bolile lizozomale de mai sus.
Conflict de interese: Autorii declară că nu au niciun conflict de interese și, în același timp, declară sincer că lucrarea nu a fost publicată într-un alt periodic.
Mulțumiri: Această lucrare a fost susținută de Ministerul Sănătății al Republicii Slovace în cadrul proiectului cu numărul de înregistrare 2019/7-CHÚSAV-4 și subvenția nr. 2/0130/18 Agenția de burse slovacă pentru știință VEGA.
Mucolipidoză ML2 (GNPTAB) - acumularea diferitelor FOS cu monozaharide terminale variabile - manoză, galactoză sau acizi sialici se observă în spectru din cauza funcției insuficiente a unor hidrolaze lizozomale, sialidaze, beta-galactozidaze sau alfa-manozidaze, enzime care utilizează produse GlcNAc-fosfotransferază (GNTP).