Tăierea circuitului circuitului central al flip-flopului, care integrează opririle senzorului opus în c

• obiecte
• abstract
• introducere
• Rezultatul
• Indiciile senzoriale mediază facilitarea sau suprimarea hrănirii
• Circuite care stau la baza facilitării puterii
• Circuite care stau la baza suprimării puterii
• Inhibarea reciprocă între neuronii NSM și RIM/RIC
• Funcția „câștigător ia totul” a circuitului central de integrare
• discuţie
• metode
• trib
• Biologie moleculara
• Teste comportamentale
• Imagistica fluorescentă
• Analiza datelor
• Mai multe detalii
• Informatii suplimentare
• Fișiere PDF
• Informatii suplimentare
• Comentarii

obiecte

• Comportamentul animalelor
• Comportamentul alimentar
• Sisteme de senzori

abstract

Comportamentul de hrănire este modulat de mediu și de condițiile fiziologice interne. Apetitul este de obicei susținut de mirosul (sau aspectul) plăcut al mâncării și distrus de gustul prost. De fapt, animalele percep multipli stimuli de mediu în același timp și nu este clar modul în care aceste intrări senzoriale sunt integrate și, prin urmare, se ia o decizie de a reglementa obiceiurile alimentare în consecință. Aici arătăm că obiceiurile alimentare ale Caenorhabditis elegans pot fi susținute fie de un miros atrăgător, fie suprimate de respingători. Prin identificarea mutanților care sunt deficienți pentru reglarea senzorială a hrănirii, am analizat un circuit central cu flip-flop care integrează două intrări senzoriale opuse și generează o ieșire hormonală bistabilă pentru a regla comportamentul alimentar. Deoarece reglementarea hrănirii este baza pentru supraviețuirea animalelor, presupunem că logica organizațională de bază identificată aici în C. elegans este probabil să convergă în diferite filite.

Animalele trebuie să se confrunte cu schimbări complicate în circumstanțele lor. Acești factori de mediu includ stimuli fizici și chimici „buni” și „răi”, precum mirosuri plăcute și respingătoare și temperaturi ridicate și scăzute. Cu toate acestea, nu este clar modul în care acești factori opuși modulează comportamentul.

Caenorhabditis elegans este echipat cu mai multe modalități senzoriale care pot detecta mediul, inclusiv mirosul, gustul, osmolaritatea, temperatura și contactul mecanic. Poate simți sute de molecule solubile în apă și volatile care pot provoca comportamente diferite, cum ar fi atracția, evitarea, hrănirea sau împerecherea 1. Două perechi de neuroni senzitivi amfidici, AWA și AWC, mediază chimiotaxia la parfumurile volatile atractive 2, în timp ce o altă pereche de neuroni chemosenzoriale, ASH, mediază evitarea osmolarității ridicate, a concentrației mari de mirosuri volatile, de alcaloizi fierbinți (de exemplu, chinină) și detergenți. 3, 4, 5. Nu este clar cât de atractive și respingătoare sunt indicațiile senzoriale pentru a regla comportamentul animalului.

C. elegans se hrănește prin pomparea energică a tubului faringian, ceea ce duce la ingestia bacteriană, concentrarea, măcinarea și împingerea suspensiei zdrobite în lumenul intestinal 6. Atunci când alegem rata de pompare ca o scădere și solicităm C. elegans cu substanțe atrăgătoare și repelente, constatăm că substanțele atractive și repelenții facilitează și suprimă hrănirea în C. elegans. Mai mult, prin identificarea și caracterizarea mutanților care sunt deficienți în facilitarea și suprimarea hrănirii mediată senzorial, demonstrăm circuitul molecular și neuronal al C. elegans, care integrează intrările senzoriale opuse în reglarea ratei de pompare. În loc de o sumă liniară de stimuli senzoriali, dezvăluim integrarea neliniară în celulele neurosecretorii centrale. Concluzionăm că funcția „câștigător ia totul” a circuitului central de integrare asigură un comportament stabil de hrănire în prezența unor stimuli de mediu zgomotoși.

Rezultatul

Indiciile senzoriale mediază facilitarea sau suprimarea hrănirii

Am testat mai întâi dacă organismele la fel de simple ca viermii își pot schimba comportamentul alimentar ca răspuns la stimuli de mediu similari cu ființele umane. Am atacat viermii fie cu arome atractive, diacetil și o concentrație scăzută de izoamilol 2, fie cu repelenți precum chinina și o concentrație ridicată de izoamilol 7, 8. Am constatat că concentrațiile de diacetil de 10% sau mai mult au crescut rata de pompare cu

25%, fenomen pe care îl numim hrănirea mai ușoară (Fig. La). Facilitarea hrănirii a fost, de asemenea, observată la concentrații scăzute de izoamilol (diluții 10-4 până la 10-5, figura suplimentară S1), un factor de atracție care este detectat în principal de neuroni AWC 2. În plus, am observat suprimarea hrănirii, în care rata de pompare a fost redusă la un nivel foarte scăzut, într-o manieră dependentă de doză la concentrații mari de izoamilol sau chinină (Fig. 1a, b). Pe baza curbelor doză-răspuns, am selectat concentrații de 100, 100% și 5-10 mM pentru diacetil, izoamilol și chinină pentru următoarele experimente, dacă nu se specifică altfel. Am măsurat rata de pompare între 5 și 10 minute când stimulii au avut efectul maxim (Fig. 1c). Efectele posibile ale acestor substanțe chimice asupra mișcării au fost excluse prin monitorizarea îndoirilor corpului în timpul expunerii pe termen scurt sau lung la substanțe chimice (Figura suplimentară S2).

Circuite care stau la baza facilitării puterii

Am examinat apoi căile de semnalizare prin diferite modalități senzoriale. Neurotransmițătorul 5-hidroxitriptamină (5-HT, serotonină) reglează comportamentul alimentar și fiziologia la diferite specii de vertebrate și nevertebrate 15, 16, 17, 18. Se știe că 5-HT crește rata de pompare în absența hranei 19, în timp ce mutanții tph-1 care nu reușesc să sintetizeze 5-HT prezintă hrană redusă 17. În prezența alimentelor, se raportează că 5-HT exogen (13 mM) nu stimulează pomparea 20. În contrast, am observat

Creșterea cu 25% a ratei de pompare la administrarea exogenă de 2 mM 5-HT (Fig. 2a), în concordanță cu observațiile făcute în studiul lui Srinivasana și colab., 21 în care s-a utilizat 5 mM 5-HT. Interesant, am confirmat că doar concentrațiile scăzute de 5-HT (2-5 mM) ar putea facilita hrănirea în prezența alimentelor (Figura suplimentară S8), sugerând că concentrațiile mari de 5-HT pot induce adaptarea sau autoinhibarea reglării nutriționale. sugerat de Hobson și colab. Îmbunătățirea mediată de diacetil, dar nu 5-HT mediată în pompare, a fost abolită la mutanții tph-1 (Fig. 2a, b), sugerând implicarea 5-HT în facilitarea nutrițională mediată senzorial. În hermafroditul C. elegans, expresia tph-1 este limitată doar la câțiva neuroni serotoninergici, cum ar fi NSM, ADF și HSN 17, 22. Pentru a localiza site-ul de eliberare 5-HT, am folosit promotori neuronali-specifici pentru a conduce expresia TPH-1 în mutanții tph-1. Reconstituirea tph-1 într-un subgrup de celule care se suprapun cu neuronii serotoninergici în NSM a salvat facilitarea hrănirii (Figura 2c), sugerând că TPH-1 acționează în neuroni NSM.

Tabel în dimensiune completă

Circuite care stau la baza suprimării puterii

Cu toate acestea, inhibarea pompării indusă de chinină și izoamilol a fost complet blocată în mutanții tdc-1, în timp ce pomparea în mutanți tbh-1 a fost doar parțial inhibată (Fig. 3a și Fig. Suplimentară S10a). tbh-1 codifică TA β-hidroxilaza necesară pentru conversia TA în OA30. Aceste rezultate sunt în concordanță cu rolul inhibitor al TA/OA în reglarea de pompare 32 .

Inhibarea reciprocă între neuronii NSM și RIM/RIC

A - d ) Eșantioane de cursuri de timp și statistici ale nivelului de calciu NSM ( A, ) și RIM ( c, d ) a neuronilor animalelor în mișcare liberă pe hrană în absență (control) sau în prezența diacetilului 100% (roșu). și 5 mM chinină (albastru). Căsuțele gri indică durata aplicației chimice. ( e ) Capacitatea diacetilului de a inhiba nivelurile de calciu în neuronii RIM s-a pierdut la mutanții tph-1 și mod-1, dar a fost salvată prin expresia transgenică a tph-1 în NSM și mod-1 în neuronii RIM/RIC. ( f ) Inhibarea indusă de chinină a nivelurilor de calciu în neuronii NSM a fost abrogată la mutanții tdc-1 și ser-2, dar a fost salvată prin expresia transgenică a tdc-1 în RIM/RIC și ser-2 în neuronii NSM. Ptdc-1 pentru RIM/RIC, Ptph-1 pentru NSM au fost utilizate ca promotori. Statistici ( , d - f ): * P

metode

trib

Tulpinile de C. elegans au fost cultivate în plăci cu mediu de creștere a nematodelor (NGM) la 20 ° C folosind celule bacteriene E. coli OP50 ca surse alimentare conform metodelor standard 39 .

Tulpinile au fost obținute de la CGC (//www.cbs.umn.edu/CGC/) și Proiectul Național de Resurse Bio (//www.shigen.nig.ac.jp/c.elegans/index.jsp). Tulpinile utilizate sau generate în acest studiu sunt enumerate în tabelul suplimentar S1. Animalele cu mutații duble și triple cu combinația dorită de mutații au fost confirmate prin PCR și secvențiere. Toate tulpinile transgenice au fost generate folosind metodele publicate 40. Plasmidele au fost injectate la 50 ng μl -1 împreună cu unc-122: rfp (20 ng μl -1) ca marker de co-injecție, dacă nu se indică altfel. Au fost testate cel puțin trei linii independente pentru fiecare experiment de salvare.

Biologie moleculara

Tehnologia Gateway a fost utilizată pentru producția de construcții. Secvența de codificare GFP a vectorului pPD95.75 (un cadou de la A. Fire) a fost înlocuită cu genele tdc -1 G-CaMP 2.0, TagRFP-T sau C. elegans pentru a crea o serie de vectori modificați. Caseta attP1-ccdB-CmR-attP2 a fost amplificată prin PCR din pDONR221 (Invitrogen) cu un oligo conținând fie Hin dIII, fie situri de restricție Age I. Fragmentul PCR a fost apoi purificat cu gel și subclonat în site-urile unice Hin dIII și Age I din pPD95 .75 și alți vectori modificați enumerați mai sus pentru a obține vectori de intrare a porții modificate.

Promotorii tph-1, tdc-1, gcy-13, tbh-1 și mod-1 au fost amplificați prin PCR din ADN genomic N2 folosind primerii care conțin reziduuri attB1 și attB2. Aceste fragmente PCR au fost recombinate cu situsuri attP1 și attP2 în vectori donatori modificați prin reacție BP recombinantă. În acest fel, P tph-1: G-CaMP2.0, P tdc-1: G-CaMP2.0, P tph-1: GFP, P tdc-1: GFP, P mod - 1: Creat de plasmidele TagRFP-T, Pgcy-13: tdc-1 și Ptbh-1: tdc-1. Lungimile promotorilor tph-1, tdc-1, gcy-13, mod-1 și tbh-1 sunt 4, 5, 4, 4, 2, 3, 5, 5 și 4, 6 kb.

Pentru a construi plasmida P tph-1: ser-2, secvența ADNc a genei C. elegans ser-2 a fost subclonată în siturile SalI și KpnI ale vectorului pPD49.26 (un cadou de la A. Fire). Promotorul tph-1 a fost apoi inserat între siturile SphI și Sal I ale vectorului.

Pentru a construi plasmida P tdc-1: mod-1, un fragment de ADN genomic de 4.073 bp conținând toți intronii și exonii mod-1 a fost amplificat PCR din ADN genomic N2 și subclonat în siturile NheI și KpnI ale vectorului pPD49.26. Promotorul tdc-1 a fost apoi inserat între siturile BamHI și NheI din vector.

Pentru a construi plasmida Ptph -1: glr -7, un fragment de ADN genomic de 3.657 bp conținând toți intronii și exonii glr-7 a fost amplificat prin PCR din genomul ADN N2 și subclonat în siturile Nhe I și KpnI din pPD49.26. Promotorul tph-1 a fost inserat în siturile MscI și NheI ale vectorului.

Teste comportamentale

Toate testele comportamentale au fost efectuate pe adulți tineri. Pentru a testa viteza de pompare, am măsurat timpul necesar pentru finalizarea a 20 de pompe. Au fost înregistrate patru până la șase măsurători pentru fiecare animal și cel puțin 8 până la 12 animale au fost testate pe experiment, toate experimentele fiind repetate de cel puțin trei ori. Pentru a testa efectul diferitelor substanțe chimice volatile asupra modulației furajelor, viermii tineri bine hrăniți au fost transferați pe plăci noi cu semințe OP50. După 10 minute, 2 ul de substanțe chimice volatile (diacetil sau izoamilol, toate de la Sigma) au fost adăugate la capac și placa a fost sigilată timp de 5 minute înainte de a înregistra rata de pompare. Serotonina, TA și OA au fost dizolvate în tampon M9 și răspândite pe plăcile NGM alimentare la o concentrație finală de 2 mM. Chinina a fost dizolvată în tampon M9 la o concentrație de 5 mM și plasată pe plăci NGM. Adulții tineri au fost transferați pe aceste plăci NGM după 2 ore și numărul pompelor a fost numărat după 5 minute timp de 10 minute. S-a adăugat tampon M9 pe placă pentru control.

Excluderea izoamilolului 100% a fost măsurată așa cum a fost descris anterior 5 cu modificări minore: animalele bine hrănite au fost transferate pe plăcile alimentare cu 10 minute. Electrodul de sticlă 1 MQ acoperit a fost apoi scufundat în izoamilol 100% și plasat în fața nasului animalului animalului din față timp de 2 secunde. Răspunsul animalelor individuale în decurs de 4 secunde a fost înregistrat ca răspuns pozitiv (mișcare înapoi) sau negativ (fără mișcare înapoi).

Testul de locomoție utilizat aici s-a bazat pe testul utilizat în studiul anterior 41. Pe scurt, animalele de control și animalele expuse substanțelor chimice au fost transferate pe farfurii fără alimente. După 10 minute, numărul de flexii ale corpului frontal a fost numărat la intervale de 20 s timp de 5 minute.

Imagistica fluorescentă

Imaginile fluorescente ale G-CaMP2.0 au fost realizate la microscopul Zeiss Discovery V8 cu fluorescență cu obiectiv x20. Viermii tineri adulți care exprimă G-CaMP2.0 în neuroni NSM sau RIM/RIC au fost transferați la noi vase NGM inoculate cu OP50. O gaură a fost tăiată în capac și acoperită cu un capac de 25 mm 00 # la care s-au adăugat 2 ul de substanțe chimice volatile. Chinina a fost adăugată direct pe placa de agar. Plăcile au fost apoi sigilate și, după 5 minute de stimulare chimică, au fost realizate imagini ale corpurilor celulare atunci când rata de pompare a crescut deja (diacetil) sau a scăzut (izoamilol sau chinină). Un microscop cu fluorescență inversată Olympus IX81 echipat cu un obiectiv × 20, NA0.75, a fost folosit pentru a măsura cursul de timp Ca 2+. Pentru a menține neuronul viermelui în mișcare în câmpul vizual al dispozitivului încărcat, am folosit sistemul PhotoTrack de la Instrumentarea Științifică Aplicată (ASI, Eugene, SUA) combinat cu etapele XI ale ASY cu ciclul închis 42. Fluorescența neuronilor G-CaMP2.0 NSM sau RIM/RIC la viermi în mișcare liberă a fost înregistrată de sistemul PhotoTrack folosind un Andor Luca EM-CCD la 2 Hz.

Co-localizarea tdc-1: GFP și mod-1: TagRFP-T sau tph-1: TagRFP-T și ser-2: GFP a fost investigată utilizând sistemul de microscopie confocală laser Andor Revolution XD bazat pe rotație - cap de scanare confocal de disc, CSU-X1 (Yokogawa Electric), sub controlul software-ului Andor IQ 1.91. Un microscop confocal a fost construit pe un microscop inversat Olympus IX-71 (Olympus, Tokyo, Japonia) echipat cu un obiectiv x60 (diafragmă numerică = 1,45, Olympus, Japonia). Imaginile au fost afișate și analizate folosind Image-J 1, 43b (Wayne Rasband, National Institutes of Health, SUA).

Analiza datelor

Analiza datelor a fost efectuată utilizând IGOR Pro 5.01 (Wavemetrics, Portland, OR, SUA). Rezultatele sunt raportate ca valori medii ± 10-12 animale, cu excepția cazului în care se indică altfel. Semnificația statistică a fost evaluată folosind testul t Student. Asteriscurile indică semnificația statistică: * P