obiecte
abstract
Scopul acestui studiu a fost de a investiga utilitatea secvențierii următoarei generații (NGS) a unui număr mare de gene asociate cu canalopatii cardiace și cardiomiopatii într-un grup de 61 de victime SUD într-un mediu criminalistic din Danemarca.
Materiale și metode
Populația de studiu
Între 2009 și 2011, 348 de persoane tinere (1-50 de ani) decedate despre care se presupunea că au murit din cauze naturale au fost autopsiate la secția de patologie criminalistică, Departamentul de Medicină Legală, Facultatea de Sănătate și Medicină, Universitatea din Copenhaga. Dintre aceștia, 142 de persoane au fost clasificate drept SCD, inclusiv cazuri cu autopsie negativă. Un total de 61 de persoane au murit brusc, în mod neașteptat și fără descoperiri patogene după un examen macro- și histopatologic amănunțit. Screeningul toxicologic nu a relevat niciun medicament la nivel toxic care ar putea explica moartea în niciunul dintre aceste cazuri. Celelalte 81 de cazuri au fost investigate în studii anterioare pentru alte cauze cardiace de deces. Douăzeci de subiecți au fost clasificați ca cardiomiopatie (cardiomiopatie aritmogenă ventriculară dreaptă (ARVC) = 14, cardiomiopatie hipertrofică (HCM) = 6), 52 de subiecți care au avut anomalii structurale cardiace non-diagnostice la 15 și 9 subiecți ca moarte bruscă neașteptată din copilărie. 16
Testarea genetică
Până în prezent, am descris metode de cercetare genetică în Hertz și colab. Pe scurt, ADN-ul a fost extras din întregul sânge a 57 de persoane folosind QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Stockach, Germania). ADN-ul a fost extras din mușchiul proaspăt înghețat de la un subiect și din țesutul splinei proaspăt înghețat de la trei subiecți folosind trusa de investigare ADN EZ1 (Qiagen). ADN-ul extras a fost cuantificat cu kitul de cuantificare ADN uman Quantifiler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) conform protocolului producătorului. ADN-ul din cele două probe a fost amplificat în întregul genom folosind kitul REPLI-g Midi (Qiagen) conform protocolului producătorului datorită concentrației scăzute de ADN.
NGS a fost utilizat pentru a examina 100 de gene care anterior s-au găsit asociate cu boli cardiace moștenite și SCD (Tabelul 1). Genele au fost selectate din literatura disponibilă în PubMed și Online Mendelian Inheritance in Man (//omim.org/).
Tabel în dimensiune completă
SureDesign (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA) a fost utilizat pentru proiectarea sondelor de captare pentru regiunile țintă ale exonului și UTR de la 100 de gene pentru sistemul de îmbogățire a sistemului țintă Haloplex de 150 bp (Agilent Technologies). Proiectarea a inclus toți exonii de codificare, introni contiguați de 25 pb și regiuni UTR de 5 'și 3' de la 100 de gene dorite până la un total de 2076 de regiuni cu o dimensiune totală de 787.943 pb. În general, 99,6% din țintă a fost acoperit> 50 ×. Doi exoni nu au fost acoperiți suficient de secvențializare și șapte exoni nu au fost secvențați din cauza lipsei proiectării sondei. Detalii despre regiunile genomice care nu sunt suficient acoperite pot fi găsite în Tabelul suplimentar S1. Acoperirea mediană pentru ampliconi a fost de 950 (interval: 206 - 3065).
Protocolul Haloplex Target Enrichment, versiunea D.5, a fost utilizat conform instrucțiunilor producătorului. Protocolul a inclus următorii pași: (1) digestia a 200 ng de ADN genomic cu diferite enzime de restricție în opt tuburi și analiza fragmentelor utilizând un Bioanalizator 2100 (Agilent Technologies); (2) hibridizarea ADN-ului digerat cu sonde Haloplex cu capete de sondă care erau complementare fragmentelor țintă. În timpul hibridizării, fragmentele au fost circularizate și au fost încorporați indici, motive de secvență și biotină; (3) ADN-ul țintă a fost capturat cu margele magnetice Haloplex; (4) crestăturile din fragmente circularizate au fost închise prin ligare; și (5) eluare cu NaOH, amplificare PCR, purificare și eluție finală cu tampon Tris-HCI al ADN-ului țintă capturat. După asamblarea bibliotecii, cantitatea de ADN a fost măsurată folosind un fluorometru Qubit 2.0 cu un test dsDNA HS (Invitrogen, Life Technologies Europe BV, Nærum, Danemarca). Distribuția dimensiunii ADN-ului a fost analizată folosind un bioanalizator 2100 și un kit ADN de înaltă sensibilitate (Agilent Technologies). Toate probele au fost secvențiate pe MiSeq (Illumina, San Diego, CA, SUA) în conformitate cu recomandările producătorului, cu secvențierea finală asociată de 150 bp folosind MiSeq Reagent Kit V2 (300 cicluri).
Analiza datelor și bioinformatica
Până în prezent, am descris în detaliu analiza datelor în Hertz și colab. Pe scurt, fișierele fastq create de MiSeq au fost utilizate pentru aliniere și analiză ulterioară. SureCall (Agilent Technologies) a fost folosit pentru a analiza apelurile de bază folosind setările standard și algoritmul lor standard. O listă completă a variantelor identificate a fost dată în Variant Caller Format.
Alamut Batch v.1.2.0 și Alamut Visual v.2.5 (Interactive Biosoftware, Rouen, Franța) au fost utilizate pentru adnotarea și evaluarea variantelor descrise în Hertz și colab. Variantele au fost evaluate de (1) un instrument analitic in vitro in vitro dezvoltat pentru a determina probabilitatea patogenității variante și (2) frecvențe de 17
Varianta a fost clasificată ca având o semnificație necunoscută, în caz de frecvență peste prevalența bolii, conform literaturii disponibile, substituție de aminoacizi neconservată, observații multiple ale variantei în cohortă sau lipsa unei asocieri semnificative cu orice boală cardiacă și nucleotide din regiunile în care s-a găsit varianta.
Genele și variantele ADN au fost numerotate în conformitate cu secvențele de referință utilizate în Tabelul 1 utilizând nomenclatura HGVS (www.HGVS.org). Variantele au fost trimise la baza de date Leiden Open Variation Database (//databases.lovd.nl/shared/individuals, ID individual: 00064702–00064741).
Acoperirea a fost calculată folosind un script python care calculează acoperirea pentru fiecare ampplicon folosind Bedtools CoverBed. Ampliconii, în care toate eșantioanele aveau 23, au fost folosite pentru a efectua analize statistice și a evalua variante in analiza in silico folosind un script personalizat.
Standarde etice
Studiul a fost aprobat de Comitetele pentru Etica Cercetării în Sănătate din Danemarca (H-2-2012-017) și Agenția Daneză pentru Protecția Datelor (2011-54-1262).
Rezultatul
Populația de studiu
Am inclus 61 de persoane care, după o examinare medicală amănunțită, au murit brusc și neașteptat fără descoperiri patogene și au fost clasificate ca SUD. Vârsta medie la deces a fost de 39 de ani (interval 1-50) și 43 (70%) bărbați (Tabelul 2). Examinările toxicologice post-mortem au fost efectuate în 54 (89%) cazuri, dintre care 16 (30%) au fost negative. Nu a fost găsit niciun medicament într-o concentrație toxică care ar putea explica moartea în niciunul dintre aceste cazuri.
Tabel în dimensiune completă
Doi indivizi decedați (3%) aveau antecedente familiale de boli de inimă. Tatăl unei persoane a murit la vârsta de 56 de ani dintr-o cauză cardiacă nespecificată. Nu a fost găsită nicio variantă cu un efect funcțional probabil la acest individ. Două rude apropiate ale celeilalte persoane au murit în timpul somnului la o vârstă fragedă, fără un motiv cunoscut. Două variante cu efecte funcționale probabile au fost găsite la acest individ (Tabelul 3, ID 7).
Tabel în dimensiune completă
În studiul nostru, 16 (26%) cazuri de SUD au avut boli psihiatrice în conformitate cu dosarele medicale disponibile. Șapte (13%) și opt (15%) au folosit antipsihotice. Antidepresive. Conform RCP disponibil, antipsihoticele și antidepresivele utilizate la persoana decedată au avut o frecvență foarte scăzută sau necunoscută a prelungirii QT c. În plus, 14 (23%) cazuri de SUD au prezentat epilepsie și 10 (19%) au avut unul sau mai multe medicamente antiepileptice în sânge (Tabelul 2). Niciunul dintre medicamentele utilizate pentru tratarea epilepsiei nu a avut o frecvență cunoscută de prelungire a intervalului QT în funcție de SPC disponibil.
Variante cu efect funcțional probabil și necunoscut
În total, 21 (34%) persoane au avut 25 de variante genetice care au fost clasificate ca susceptibile de a avea efecte funcționale (Tabelul 3). Zece dintre aceste variante erau noi. Vârsta medie a subiecților cu efecte funcționale probabile a fost de 36 de ani (interval 1-49) și a inclus 11 bărbați (52%). Dintre variantele cu efect funcțional probabil, au existat 22 de mutații fără sens și 3 mutații fără sens (Tabelul 3). Zece (40%) și 15 (60%) variante au fost găsite în gene descoperite anterior ca fiind asociate cu cardiomiopatii sau canalopatii cardiace. Șapte dintre indivizii care au avut variante cu efecte funcționale probabile au avut, de asemenea, variante de efect funcțional necunoscut. În plus, 19 indivizi poartă doar variante genetice cu efect funcțional necunoscut (datele privind variantele necunoscute sunt date în tabelul suplimentar S2). Restul de 21 (34%) subiecți nu au avut nicio variantă cu efect funcțional probabil sau necunoscut.
Activitatea fizică în momentul morții
Șase (10%) cazuri de SUD au murit în timpul activității fizice. Patru dintre ele au avut variante cu un efect funcțional probabil. O femeie de 39 de ani sa prăbușit la mers și a avut o variantă cu un efect funcțional probabil în KCNJ8 (c.1066C> T, p. (R356 *)). Nu a prezentat anterior simptome de boli de inimă. Două persoane au murit în timpul scufundării: o femeie de 46 de ani care avea o variantă cu un efect funcțional probabil în MYBPC3 (c.442G> A, p. (G148R)) și o altă în TNNC1 (c.433G> A, p ( D145N)) și un bărbat de 35 de ani cu o variantă susceptibilă să aibă un efect funcțional în MYBPC3 (c.3742G> A, p. (G1248R)). Doi scafandri nu au raportat niciun simptom anterior care indica boli de inima. Un tânăr de 15 ani s-a prăbușit brusc în timpul unei alergări de fotbal. El a avut o variantă cu un efect funcțional probabil în CACNB2 (c.641G> C, p. (S214T)) și cealaltă în MYBPC3 (c.649A> G, p. (S217G)). În trecut, el a avut două evenimente sincope în timpul fotbalului, iar când a murit, a fost examinat pentru boli de inimă. ECG a prezentat extrasistolă ventriculară, dar nu s-a făcut niciun diagnostic.
discuţie
Am secvențiat 100 de gene asociate bolilor de inimă în 61 de cazuri daneze de SUD folosind NGS. Una sau mai multe variante cu un efect funcțional probabil au fost identificate la 21 (34%) persoane. Dintre cei 21 de indivizi, 12 au avut variante cu efecte funcționale probabile exclusiv în gene asociate anterior cu boli de ioni cardiaci. Șase persoane au avut variante cu efecte funcționale probabile exclusiv în gene asociate anterior cu boli cardiomiopatice. Trei indivizi au avut variante cu efecte funcționale probabile la gene asociate cu canulopatia și cardiomiopatia.
Frecvența variantelor în gene asociate cu cardiomiopatia a fost mai mare decât se aștepta. Cardiomiopatiile sunt adesea variabile în expresie și cu penetrare incompletă, iar modificările fenotipice inițiale pot să nu fie vizibile la necropsie sau pot fi considerate nespecifice sau în intervalul normal. Variantele raportate a fi asociate cu cardiomiopatii și modificări structurale ale inimii pot duce la aritmii - și, în unele cazuri, mediate de disfuncții cardiace. Acest lucru este susținut de studii funcționale ale genelor desmosomale care s-au dovedit anterior a fi asociate cu ARVC. 3, 4, 5, 6 Gena PKP2 s-a dovedit a fi prima dată asociată cu ARVC atunci când Gerull și colab 24 au descoperit că există 25 de variante în PKP2 la 32 de pacienți cu ARVC. Variante de PKP2 au fost găsite în
70% din toate cazurile ARVC. 4, 25 Recent, sa descoperit că PKP2 este asociat cu BRS fără anomalii cardiace structurale. 3, 4 Cerrone și colab. 3 au găsit variante PKP2 la 2,5% dintre pacienții cu BRS studiați. Prin urmare, în acest studiu, s-a sugerat că PKP2 va juca un rol în transferul canalelor de sodiu pe discul intercalat printr-un mecanism necunoscut. 3 Zhang și colab. 4 au găsit același număr de variante PKP2 la pacienții cu ARVC și SUD cu autopsie negativă și au concluzionat că moartea subită se poate datora aritmiei prin localizarea redusă a proteinelor canalului Nav1.5 către discul intercalat, crescând astfel distanța dintre capătul plus al microtubulilor și placa centrală N- cadherină. Variantele din DSP și DSG2, care fac parte, de asemenea, din complexul desmosomal cardiac, s-au dovedit a fi asociate în mod similar cu disfuncția Nav1.5 la șoareci și celule HL-1. 5, 6 Mutațiile genelor sarcomomerice au fost prezente și în cazurile de sindrom de moarte subită a sugarului (SIDS) în care nu a fost observată nicio modificare structurală. Brion et al 26 au găsit mai multe variante descrise anterior în genele sarcomere la 286 victime SIDS. Ei au sugerat că variantele genelor sarcomere ar putea fi cauza decesului la acești copii, chiar dacă copiii nu au avut modificări structurale în inimă.
În acest studiu, am constatat că două treimi (40 de persoane) din cazurile SUD au avut variante cu efecte funcționale necunoscute sau nu au variante cu efecte funcționale probabile sau necunoscute. Cauza morții acestor indivizi rămâne încă fără răspuns și ridică noi întrebări; Există alte gene sau elemente reglatoare (metilare, miARN etc.) care se găsesc numai în cazuri de SUD și nu sunt niciodată prezente la indivizii care suferă de boli de inimă? Ar fi interesant să cercetăm în continuare aceste cazuri prin secvențierea întregului genom și investigarea factorilor epigenetici.
Activitatea fizică în momentul morții
Șase (10%) cazuri de SUD au murit în timpul activității fizice, inclusiv mersul pe jos, scufundări, ciclism sau fotbal. Patru dintre acești șase indivizi au avut variante cu efecte funcționale probabile, dintre care trei au fost în MYBPC3. Scufundătorul în vârstă de 46 de ani a avut o variantă observată anterior de MYBPC3 (c.442G> A) la un pacient cu HCM. Scufundătorul de sex masculin în vârstă de 35 de ani a avut o variantă de MYBPC3 (c.3742G> A) observată anterior la un alt pacient cu HCM 28 și clasificată ca fiind susceptibilă de a fi patogenă. Un jucător de fotbal în vârstă de 15 ani a avut variante ale MYBPC3 (c.649A> G) în studiu, unde această variantă a fost găsită în două cazuri de SIDS și descrisă ca fiind potențial patogenă. Într-un alt studiu, această variantă a fost găsită la o femeie de 19 ani care a avut stop cardiac după începerea tratamentului și a fost ulterior diagnosticată cu HCM. În plus, varianta a fost descrisă de același studiu ca în textul anterior de Andreasen și colab., 29, care au descoperit că această variantă are o frecvență scăzută și posibil una patogenă. Toate cele trei persoane cu variante MYBPC3 cu efect funcțional probabil au efectuat exerciții ușoare până la severe în momentul decesului.
Moarte subită neașteptată în cazul bolilor psihiatrice și epilepsiei
În acest grup de SUD, 16 (26%) cazuri de SUD au avut boli psihiatrice în conformitate cu dosarele medicale disponibile (Tabelul 2). La cinci (31%) persoane cu boli psihiatrice, au fost identificate una sau mai multe variante cu un efect funcțional probabil. Variante au fost găsite în genele SCN5A, KCNQ1, TTN și LMNA. Prevalența SUD la tinerii deprimați nu a fost studiată pe scară largă. Se știe că speranța medie de viață în Danemarca pentru pacienții cu schizofrenie este cu 16-20 de ani mai mică decât pentru populația generală. Într-un studiu recent din Australia, Sweeting și colab. 32 au constatat că cea mai frecventă cauză de deces la pacienții cu schizofrenie a fost boala cardiovasculară (23%) și că 11% dintre decese au fost inexplicabile după autopsie.
Cauzele principale ale SCD și SUD în tulburările psihiatrice nu au fost stabilite, dar aritmiile induse de medicamente s-au sugerat a fi importante în depresia 33 și schizofrenia. 34, 35, 36, 37
Acest studiu are unele limitări. În primul rând, este o cohortă foarte selectată, care poate reduce generalizabilitatea descoperirilor noastre. Studiile funcționale și analizele de segregare în familii ar trebui efectuate pentru a investiga în continuare variantele cu efecte funcționale probabile. Constatările genetice din acest studiu nu pot determina în sine cauza morții, deoarece multe dintre variantele identificate sunt noi și necesită investigații suplimentare.
Pe scurt, am constatat că o treime din persoanele moarte cu necropsie criminalistică negativă au una sau mai multe variante cu un efect funcțional probabil în genele asociate cu cardiomiopatiile și canalopatiile cardiace. În plus, s-a constatat că 19 și 21 de persoane au doar variante cu semnificație necunoscută sau fără variante de semnificație. Descoperirile noastre sugerează că screening-ul genetic extensiv utilizând NGS este o parte utilă de diagnostic a investigației criminalistice în cazurile de SUD în care nu este posibil să se determine cauza decesului după o autopsie de rutină. Deoarece o proporție semnificativă de variante cu un efect funcțional probabil au fost identificate la gene care s-au dovedit a fi asociate cu cardiomiopatii, sugerăm că testarea genetică a victimelor SUD include gene implicate atât în boli cardiace structurale, cât și nestructurale. În plus, două treimi din indivizii la care nu a fost identificată nicio variantă cu un efect funcțional probabil ne fac să ne întrebăm dacă există alte gene sau elemente de reglare care nu au apărut încă în aceste decese inexplicabile.