abstract
Principalul
Imagine la dimensiune completă
Am investigat distribuția izoenzimei PKA (Figura 1c). În Cc, Ct - m mutant și RI și transfectanți, nivelurile de PKA-I au crescut de 1,5 ori fără a modifica nivelurile de PKA-II. În RII și transfectanți, nivelurile de PKA-I au scăzut cu 40%, iar nivelurile de PKA-II s-au dublat. Transfectanții RII p și RII p-P au redus semnificativ nivelurile de PKA-I (la 25% din nivelurile de celule parentale) și au dublat PKA-II. Astfel, supraexprimarea R1a sau C7 nu a putut suprima expresia PKA-II, în timp ce supraexpresia RIIa, RIIp sau RIIp-P a redus semnificativ expresia PKA-I, indicând o producție favorabilă de PKA-II față de PKA-I (Otten și McKnight, 1989, Otten și colab., 1991; Nesterova și colab., 1996; Lee și colab., 1999). O constatare notabilă este că RIa-P mutant, spre deosebire de RIa de tip sălbatic, poate suprima PKA-II (Figura 1c, RIa-P), așa cum s-a arătat anterior în alte celule canceroase (Lee și colab., 1999). la afinitate mai mare C a pentru Ria-P mutant decât pentru Ria, RIIa sau RIIp (Lee și colab., 1999).
Celulele RII p și RI α-P au arătat o creștere a nucleilor apoptotici (Figura 1d și e). În plus, aceste celule au reglementat în jos proteina antiapoptotică Bcl-2; proteine proapoptotice Bax, Bak și Bad reglementate în sus; și hipofosforilarea slabă crescută (Figura 1f), indicând faptul că promovarea apoptozei ca Fosforilare proastă duce la antiapoptoză (Harada și colab., 1999).
Am investigat proprietățile de creștere ale transfectanților genei subunității PKA in vitro și in vivo. În cultura monostrat, transfectanții RIIp și R1a-P au prezentat o inhibare a creșterii cu 80%, iar transfectanții RIIa și RIIP-P au prezentat o inhibare ușoară a creșterii (Figura 1g). În schimb, R1a, Cc-m, C a sau transfectanți numai vectoriali au crescut la aceeași rată sau mai rapid decât celulele de control parental. Mai mult, într-un model de șoarece nud, creșterea tumorii in vivo a fost redusă semnificativ numai în transfectanții RIIp și RI α-β (Figura 1h).
Inhibarea creșterii tumorii in vivo observată în transfectanții RIIp și RI α-β s-a corelat cu modificările morfologiei lor celulare în cultura celulară in vitro. Celulele parentale netransfecționate au prezentat o morfologie în formă rotundă, prezentând în principal un nucleu mare cu o citoplasmă mică și au crescut prin acumulare (Figura 1j). Modificări semnificative ale morfologiei celulare au apărut în celulele RII p și RI α-P. Aceste celule au prezentat un fenotip plat mare sau prelungit care seamănă cu revertantul plat descris anterior (Noda și colab., 1985). Ambele celule au prezentat o citoplasmă mărită și un nucleu mai mic, ceea ce a dus la creșterea raportului citoplasmă la nucleu și a crescut ușor (Figura 1j). Toți ceilalți transfectanți - Ca, Cc - m, RIIa, RIIa și RIIp - P - au prezentat o morfologie similară agenților parenterali neinfecțioși (Figura 1j).
Imagine la dimensiune completă
Analiza nordică a genelor modificate în celulele PC3M transfectate cu gene PKA C și RII p. ARN celular total a fost preparat din celule PC3M parenterale și transfectate folosind kitul Rneasy Midi (Qiagen, Chatsworth, CA, SUA), electroforeză, blotare cu membrană din nylon și a fost supus analizei Northern blot (Nesterova și colab., 1996). Datele reprezintă unul dintre cele două experimente independente care au dat rezultate similare. Fragmente specifice de ADNc corespunzătoare genelor respective au fost generate prin PCR. TGFBR3, factor de creștere transformant, receptor beta III; AKT2, omolog oncogen viral 2 al timomului murin; MMP-1, metaloproteinaza matrice 1; RBBP2, proteina de legare a retinoblastomului 2; PAI2, inhibitor al activatorului plasminogenului, tip II; AOE372, tioredoxin peroxidază
Imagine la dimensiune completă
Astfel, inversarea tumorală indusă de RII β poate implica dereglarea ciclului celular care duce la oprirea ciclului celular, precum și inducerea apoptozei (Figura 1d-f). În mod surprinzător, un grup de gene implicate în diferențierea celulară a fost indus în celulele care exprimă RII-β și aceste gene au fost neschimbate în celulele de represiune C18 (Figurile 2c și 3). Un studiu recent al analizei genomice a genelor vizate de CREB a relevat o cerință pentru un promotor nuclear pentru sensibilitatea la AMPc (Conkright și colab., 2003). Este posibil ca genele de diferențiere induse în celulele RII β să poată fi ținte pentru inducerea genei mediate de RII β (Srivastava și colab., 1998) fie direct, fie indirect, prin CRE/CREB. Caracterizarea ulterioară a acestor gene de diferențiere aruncă lumină asupra mecanismului de semnalizare PKA în apoptoza/diferențierea celulelor tumorale.
Aceste rezultate arată că celulele represive R1α și C care conțin PKA-I reglate în sus au arătat modificări ale profilului de expresie genică care erau opuse celor ale celulelor RII celule care re-exprimă p conținând în principal PKA-II. Astfel, microarrays-urile ADNc au dezvăluit semnalizarea AMPc pozitivă și negativă pentru creșterea celulelor tumorale indusă de expresia diferențială a subunităților de reglementare PKA.
Apoi, am folosit microscopie confocală pentru a examina localizarea intracelulară a Cp și RIIp (Figura 4a). Celulele parentale și celulele cu celule supraexprimante Cα-, R1a și R1- și -P au prezentat toate colorarea Cα (verde) și colorarea RIIB (roșie), care a fost exclusiv citoplasmatică; C și RII p au fost colocalizate așa cum se arată în imaginea suprapusă (galben). La acești transfectanți, puține celule au prezentat un site clar în colorarea C și RII p, care a fost galbenă în suprapunere și a fost confirmată examinând secțiuni din nucleu. În plus, celulele R1 și -expresie au exprimat colorarea Cα și RIIβ concentrată în regiunea perinucleară, în timp ce celulele care supraexprimă R1a-β au arătat o creștere a colorării RIIβ pe tot parcursul citoplasmei și în centrul aparent organizând microtubulii.
Imagine la dimensiune completă
Celulele p-represive RII păreau mărite. Au fost prezente mai puține celule, care este una dintre ele. Cel mai important, în această vizualizare suprapusă, α și RII p par a fi complet colocalizate. Această colocalizare subcelulară a RIIp și C7 nu a fost limitată la celulele apoptotice RIIp. Când celulele RII β, în absența tratamentului cu Zn 2+, au exprimat doar o cantitate limitată de RII β (transcriere condusă de LTR (Nesterova și colab., 1996)), în care celulele erau proapoptotice, cola de C a și RII β au fost observat, de asemenea (Fig. 4b). indicând faptul că colocalizarea Ct-RIIp previne apoptoza celulară. Astfel, secvențele de supraexprimare RIIβ Cc în holoenzimă cu RIIp, blochează activarea C și conduc la semnalizarea AMPc modificată în aceste celule. În mod uimitor, colorarea puternică a Cα și RII ß a fost invaginată în nucleu, confirmată de o incizie a secțiunii care se afla mai degrabă în nucleu decât în apropierea acestuia sau din cauza invaginării membranei nucleare. Această blocadă fizică a C a cauzată de RII ß în nucleul celulei poate explica profilul de expresie cel puțin parțial conflictual al transfectanților C și RII β detectați de microarrays-urile de ADN. Celulele care au supraexprimat RIIp-P sau RIIa au arătat colorarea Ca și RIIP, imitând celulele parentale, dar nu celulele care exprimă RIIp-ere.
discuţie
În studiul nostru, am supraexprimat forme de tip sălbatic și mutante ale subunităților reglatoare și catalitice ale PKA în celulele canceroase de prostată PC3M și am comparat efectul asupra formării izozimelor, morfologiei celulare, proliferării celulare, expresia genelor și fenotipul tumorii. Caracterizarea funcțională a mutației care leagă AMPc în PKA tip I a fost studiată pe larg (McKnight și colab., 1988), în timp ce analiza funcțională a subunităților RI și a sitului pseudofosforilării (Taylor și colab., 1988) a fost cu greu studiată (Durgerian și Taylor)., 1989, Lee și colab., 1999). Am folosit RI și un mutant, R1a - P, care dobândește un situs de autofosforilare (ala → ser) printr-o mutație punctuală G → T (Durgerian și Taylor, 1989; Lee și colab., 1999) pentru a imita funcțional RII. De asemenea, am folosit mutantul RII β, RII β-P, care nu are un situs de autofosforilare (ser → ala) printr-o mutație a punctului T → G (Budillon și colab., 1995). Pentru C și mutant, am folosit mutantul lipsit de miristat N-terminal, Cc-m, care s-a dovedit a fi la fel de activ ca C de tip sălbatic și în activarea PKA în celulă (Clegg și colab., 1989), în timp ce în contrastul cu Cpa de tip sălbatic nu are capacitatea de a secreta în spațiul extracelular (Cho et al., 2000).
Rezultatele noastre au arătat că celulele RIIa-, RIIp- și RIIp-P supraexprimând PKA-II și abolind aproape complet PKA-I, în timp ce celulele supraexprimante R1a-, C7 și C7-m au crescut PKA-I, dar nu am putut suprima PKA- II. În special, celulele care supraexprimă RIa-P, mimetice funcționale ale RII, au crescut PKA-I și au marcat PKA-II. PKA-II s-a dovedit a fi o formă mai preferată a holoenzimei PKA peste PKA-I (McKnight și colab., 1988). O mutație punctuală a R1a la situsul de interacțiune R și C, adică, situsul de pseudofosforilare (Taylor și colab., 1988), a dat PKA-I (RIa-P conținând PKA-I) imitând funcțional PKA-II și, ca rezultat, supraexpresia sa suprimă PKA-II endogen.
Rezultatele noastre din analiza biochimică clasică, microarrays-urile ADN și microscopia confocală susțin că subunitatea C catalitică a PKA, legată de subunitatea de reglare RIa și care formează holoenzima PKA-I, este predispusă la activare în celulă, provocând activarea unei varietăți largi de gene care promovează creșterea celulelor tumorale; dimpotrivă, atunci când subunitatea C este plasată într-o cușcă în complexul holoenzimatic PKA-II prin legarea la subunitatea de reglare RIIp, activarea subunității C este limitată, ducând la suprimarea creșterii tumorii și inducerea unui fenotip invers.
Unul dintre cele mai fascinante aspecte ale sistemului holoenzimatic PKA este capacitatea unei celule de a menține două tipuri de kinază în celulă - PKA-I și PKA-II - și de a proteja subunitatea C de apariția subunității R. La debutul carcinogenezei, PKA-I crește odată cu creșterea nivelului de adenilat ciclază și AMPc în celulă (vezi Boynton și Whitfield, 1983). Este clar că o tulburare a raportului PKA-I-PKA-II într-o celulă este un semnal anormal/periculos care poate provoca boli precum cancerul. Astfel, studiul nostru actual sugerează că schimbarea izozimelor protein kinazei A, prin inducerea semnalizării diferențiale a AMPc în celulă, poate oferi terapie genetică bazată pe PC3M de prostată țintă tumorală și alte tipuri de cancer.
Mulțumiri
Mulțumim lui Cheryl Pellerin de la Palladian Partners, Inc., care a oferit sprijin editorial Institutului Național al Cancerului în temeiul Contractului N02-BC-76512/C2700212.